1, 先選擇好探針,然后設計引物使其盡可能的靠近于探針。

　　2, 擴增子的長度應不超過400bp,理想的*能在100-150bp內,擴增片斷約短,有效的擴增反應就越容易獲得。較短的擴增片斷也容易保證分析的一致性

　　3, 保持GC含量在20%和80%之間,GC富含區(qū)容易產生非特異反應,從而會導致擴增效率的降低,及在SG分析中非特異信號。

　　4, 為了保證效率和重復性,應避免重復的核苷酸序列,尤其是G(不能有4個連續(xù)的G)

　　5, 將引物和探針互相進行配對檢測,以避免二聚體和發(fā)卡結構的形成。

　　PCR試劑盒操作流程：

　　1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,各區(qū)實驗服、儀器 、耗材應獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。

　　2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理。

　　3. 每次實驗應該設置陰、陽性對照。

　　4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,并應瞬時離心。

　　5. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū),并單獨存放。

　　6. 為防止熒光干擾,應避免裸手直接接觸PCR反應管,并應避免在PCR反應管上進行任何標記。

　　7. 儀器 擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置;不同批號試劑不能混用。

　　8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

　　9. 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。